亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质点”
或颗粒，仔细观察，可以看出这些正作有向的运动（速度很慢），水封片中
多加些水会促进这种运动。4.学
习相差显微镜，荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有关
操作技术。植
物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的
几种不同类型显微镜的使用及其对胞质环流的观察一、实验目的 学会使用相差显微镜，掌握暗视野技术，以及荧光显微镜等技术二、实验原理 在活细胞中，原生质流动是细胞活力强弱的重要标志，它的产生与细胞中微丝的作用是密不可分的。微丝的纤维较细，直径为5－6nm，主要成分是肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一样有收缩功能。微管是由一种叫做微管蛋白的蛋白质组成的，位于原生质（静止的）外质，紧靠在质膜之下，离运动的内质至少有1µm的距离，与胞质川流运动无关，主要起保持细胞形状、承担细胞运动和细胞内物质运输的作用。 另外，用秋水仙素与细胞松弛素B处理也可产生不同的结果。经秋水仙素处理后，细胞的纤维被扰乱，但不影响川流运动，这是与秋水仙素影响边缘微管作用有关。相反，用细胞松弛素B处理，就可抑制细胞的川流运动，很明显，微丝担负着川流运动的功能。胞质环流需要消耗能量，也受温度、渗透压以及离子浓度的影响。三、实验材料 新鲜洋葱鳞茎，刚毛藻等。四、实验器材 相差显微镜，普通光学显微镜，黑卡纸，载玻璃片，盖玻片，镊子，吸水纸，剪刀，滴管，擦镜纸。五、实验药品 100µg/ml秋水仙素溶液，20µg/ml细胞松弛素B(cytochalasin B)，蒸馏水，香玻油，二甲苯。六、实验步骤1.取新鲜洋葱鳞茎内表皮约1cm2 或更小，放在干净的载玻片上，加一小滴水，将盖玻片倾斜盖上，并注意不出现气泡，即制成水封片。2.取一块黑纸，把它剪成暗视野显微镜用的遮光板，并放入普通光学显微镜的聚光器下的光阑上，制成暗视野显微镜。（须反复调整遮光板的尺寸以得到最佳效果）。3.把制成的水封片放在暗视野显微镜下用10倍物镜观察，可以看到在明


染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的结
构，学会制作永久封片。二、实验原理 当
用适当浓度的TritonX—100处理细胞时，因其非离子型表面活性剂
的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋白，就不会被TritonX—100破坏而
保留在细胞中。当用考马斯亮蓝R250染色时
，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨架
，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有关的蛋白质。 考马斯亮蓝R250并不是
特异地显示微丝，但由于有些细胞骨架
纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细而
在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径约在40nm左右
。 三、实验材料 新鲜洋葱鳞状
叶。四、实验器材 普通光学显微镜，50ml烧杯
，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子，染色
板，吸水纸，擦镜纸。 五、实验药品 1．M—缓冲
液：所含各成分终浓度为50mmol／L眯唑，50mmol／LKCL，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA(乙
二醇双(α—氨基乙基》醚四
乙酸)，0.1mmol／L EDTA，lmmol／L巯基乙醇或二硫苏糖醇液(pH 6.8) 用0.2mol/L磷酸氢
二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制 其中
磷酸盐缓冲液配法：0.2mol/LNa2HPO4 49ml 0.2mol/LNaH2PO4 5lml3. 1％TrltonX—100，用M—缓冲
液配制。 4．0.2％考马斯亮蓝R250。
配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸:水(46.5：7：46.5)。 · 5. 3％戊
二醛溶液，用9.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制 6. 50％
，70％，95％乙醇。 7. 叔丁醇 8. 正丁醇 9. 二甲苯。 10.中
性树胶。六、实验步骤 1. 撕
取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小，取若干片，置于装有pH6.8磷酸盐缓冲
液的50ml烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。 2．
吸去磷酸盐缓冲液，用l％TritonX—100处理20—30min。 3. 吸
去TrironX—i00液，用M-缓冲液洗3次，每次10min左右。 4. 用3％戊
二醛固定0.5h。 5. 再
用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。 6. 0.2％考马斯亮蓝R250染色20—30min（在
染色板上）。
掌握细胞


洗1—2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察，
先低倍，再高倍，最后用油镜。 8. 如
观察结果较佳，可制作永久封片：在有样品的50ml烧杯中，依次
用如下试剂处理:50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇，(1/2)V 95％乙醇+(1/2)V叔丁醇
，叔丁醇(以上每个步骤反应5—10min)或正丁醇，正丁醇
，二甲苯，二甲苯(每个步骤5—10min)。然后，将样品置于载玻片上展开
，镜检后滴一滴中性树脂，盖上盖玻片。叶绿体
的分离与荧光观察壱
、实验目的掌握
手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点
。弐
、实验原理用
两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它 沉降系数
小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组 分
沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。参
、实验材料新鲜
菠菜叶四、实验器材组
织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心 管，
烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。 五、实验药品 匀浆介
质(0.25mol／L蔗糖、0.05mol／L Tris—HCi缓冲液，pH7.4)：称
取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约42．5ml0.lmol／LHCI，最后蒸馏水
定容至1000ml。 50％蔗糖
溶液，15％蔗糖溶液。0.35M氯化钠，0.01％吖啶橙六、实验步骤(一)叶绿体
的密度离心 l. 洗
净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5g，剪碎
。 2. 加入
预冷到近0'C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎o。 3．捣碎
液用双层纱布过滤到烧杯中。 4. 滤
液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000r／min离心1min。 5. 在2ml离
心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15％蔗糖
液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖
液面，50％蔗糖溶液加0.9ml，15％蔗糖溶液加0.5ml。加液完后，
7. 用蒸馏水


见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。 6．
在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。 7．
离心8000r／min，20min。 8. 取出离
心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻轻
吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。还可在暗室内用荧光显微镜观察。 (二)菠菜叶手切
片观察 用
剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／LNaCl溶液，加盖片后
轻压，置显微镜下观察，(1)在普通光镜下观察· (2)在荧光显微镜下观察 (3)用同样
方法制片，但滴加1～2滴0.01％吖啶橙染液染色lmin，
洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。七
、实验结果 (一)叶绿体
的分离和观察 1. 普通光镜下，可看到
叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看到
叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 以Olympus荧光显微镜为
例，在选用B《blue》激发滤片、B 双向色
镜和0-530阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 3. 加入
吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞
核则发绿色荧光。 （二）
菠菜叶手切片观察 1．
在普通光镜下可以看到三种细胞 ， (1)表皮细胞
：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。 (2)保
卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。 (3)叶
肉细胞：为排成栅状的长形和椭园形细胞。 叶绿体呈绿色橄榄
形，在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。 2．
在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要
比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体侧
环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。 3．
用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发 绿色
荧光，气孔仍为绿色。细胞组分的分离一、实验目的 掌握分
级分离方法。二、实验原理
可


用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差
速离心的方法，将各组分逐级分离出来。三、实验材料 小
鼠(30克)取肝脏四、实验器材 同实验
七 外加eppendorf管、微量进样器、tip头、台式高速冷冻
离心机。五、实验药品 匀浆介
质(0.25mol/L蔗糖＋O．Olmol/LTris-盐酸缓冲液 pH7.4)，
乙醇：冰乙酸(3：1)，生理盐水，姬姆萨染液，中性红一 詹纳
斯绿染液(称取0.04g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于l00ml， 0.25mol/L蔗糖
溶液中)。 其中0.01mo/LTris－
盐酸缓冲液配法：0.lmol/L三羟甲基氨 基
甲烷(Tris)10ml， 0.1mol/L盐酸8.4ml加蒸馏水至100ml。六、实验步骤 1.低速
离心分离细胞核(1)将
饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅 速
取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。， (2)称
取0.5g肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预��